北理工課題組在工業(yè)微生物新型堿基編輯技術(shù)方面取得重要進(jìn)展
發(fā)布日期:2023-06-08 供稿:生命學(xué)院 攝影:生命學(xué)院
編輯:肖雯 審核:周連景 閱讀次數(shù):近日,北京理工大學(xué)郭淑元教授與霍毅欣教授團(tuán)隊(duì)合作在枯草芽胞桿菌堿基編輯器研究方面取得重要進(jìn)展,。相關(guān)研究成果以“The construction of a PAM-less base editing toolbox in Bacillus subtilis and its application in metabolic engineering”為題,在頂級(jí)期刊《Chemical Engineering Journal》(影響因子:16.744)上發(fā)表(doi.org/10.1016/j.cej.2023.143865),。該工作以北京理工大學(xué)為第一通訊單位,,郭淑元教授和霍毅欣教授為共同通訊作者,博士研究生夏燕和孫麗超副研究員為共同第一作者,。
CRISPR/Cas9介導(dǎo)的堿基編輯器已經(jīng)成為了一種強(qiáng)大的基因組編輯工具,,并廣泛應(yīng)用于代謝工程等領(lǐng)域。堿基編輯器可以提前引入終止密碼子,,產(chǎn)生點(diǎn)突變,,調(diào)節(jié)基因表達(dá)水平,改造蛋白質(zhì)序列以及構(gòu)建底盤突變庫(kù)等,。然而,,堿基編輯器對(duì)特定PAM的識(shí)別需求限制了其作用范圍和編輯靈活性。為此,,團(tuán)隊(duì)首次在枯草芽胞桿菌中建立了無PAM限制的(PAM-less)的PLABE,、PLCBE以及PLACBE堿基編輯工具箱,成功實(shí)現(xiàn)了基因組上任意A/C位點(diǎn)的編輯,。同時(shí),,建立了PAM-less多靶點(diǎn)堿基編輯技術(shù),并將其應(yīng)用于代謝工程改造,,通過一次構(gòu)建產(chǎn)生16種突變菌株的組合,,成功將化學(xué)品乙偶姻的產(chǎn)量提高了26.3 %(圖一)。
論文對(duì)Cas9突變體SpRY的識(shí)別范圍進(jìn)行了系統(tǒng)掃描,,發(fā)現(xiàn)不同物種中SpRY的PAM位點(diǎn)具有不同的偏好性,。通過建立無偏差的PAM位點(diǎn)識(shí)別評(píng)估系統(tǒng),確定了枯草芽胞桿菌中SpRY最偏好的位點(diǎn)為NGG,、NGA,、NAT和NAC,最不偏好的位點(diǎn)為NCC,、NCT,、NTC和NTA。利用枯草芽胞桿菌中SpRY的PAM識(shí)別特異性信息,,我們可以在基因組編輯過程中挑選出高活性的PAM位點(diǎn),,同時(shí)避免使用效率低下的位點(diǎn)(圖二)。
PAM-less堿基編輯器可以實(shí)現(xiàn)對(duì)任意氨基酸的突變,,能夠?qū)蚪M98.8%的基因提前引入終止密碼子,,且超過50%的基因均可找到10個(gè)以上的編輯位點(diǎn)??紤]到SpRY介導(dǎo)的堿基編輯器提供了大量可編輯的位點(diǎn),,在全基因組水平預(yù)測(cè)和選擇高效編輯位點(diǎn)將是一項(xiàng)耗時(shí)的工作,。為此,我們開發(fā)了一個(gè)在線網(wǎng)站(https://bitguolab-bsbe-main-wphd8g.streamlit.app/),,用于快速檢索和生成SpRY介導(dǎo)的堿基編輯器靶向序列,,該網(wǎng)站將大幅推動(dòng)基因失活操作中的gRNA高通量設(shè)計(jì)(圖三)。
此項(xiàng)工作結(jié)合了郭淑元教授在芽胞桿菌中的研究基礎(chǔ)和霍毅欣教授團(tuán)隊(duì)在基因編輯技術(shù)方面的長(zhǎng)期積累,。近兩年,,雙方已經(jīng)合作發(fā)表了一系列高水平論文,包括枯草芽胞桿菌密碼子拓展底盤的建立( ACS Synthetic Biology , 2023, 12(2):583-595),、枯草芽胞桿菌長(zhǎng)片段敲除系統(tǒng)的建立及基因組敲除庫(kù)的構(gòu)建( International Journal of Molecular Sciences , 2022, 23(9):48-53),,以及堿基編輯領(lǐng)域研究進(jìn)展的綜述( Biology , 2022, 11, 571)、食品添加劑香蘭素的生物合成策略綜述 ( Microbial Cell Factories , 2023, In revision),。
該項(xiàng)工作得到了國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃,、國(guó)家自然科學(xué)基金以及北京市自然科學(xué)基金的支持。
分享到: