北理工課題組在工業(yè)微生物新型堿基編輯技術(shù)方面取得重要進展
發(fā)布日期：2023-06-08 供稿：生命學院 攝影：生命學院
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近日,，北京理工大學郭淑元教授與霍毅欣教授團隊合作在枯草芽胞桿菌堿基編輯器研究方面取得重要進展,。相關(guān)研究成果以“The construction of a PAM-less base editing toolbox in Bacillus subtilis and its application in metabolic engineering”為題，在頂級期刊《Chemical Engineering Journal》（影響因子：16.744）上發(fā)表（doi.org/10.1016/j.cej.2023.143865）,。該工作以北京理工大學為第一通訊單位,，郭淑元教授和霍毅欣教授為共同通訊作者，博士研究生夏燕和孫麗超副研究員為共同第一作者,。
CRISPR/Cas9介導的堿基編輯器已經(jīng)成為了一種強大的基因組編輯工具,，并廣泛應(yīng)用于代謝工程等領(lǐng)域。堿基編輯器可以提前引入終止密碼子,，產(chǎn)生點突變,，調(diào)節(jié)基因表達水平，改造蛋白質(zhì)序列以及構(gòu)建底盤突變庫等,。然而,，堿基編輯器對特定PAM的識別需求限制了其作用范圍和編輯靈活性。為此,，團隊首次在枯草芽胞桿菌中建立了無PAM限制的（PAM-less）的PLABE,、PLCBE以及PLACBE堿基編輯工具箱，成功實現(xiàn)了基因組上任意A/C位點的編輯,。同時,，建立了PAM-less多靶點堿基編輯技術(shù)，并將其應(yīng)用于代謝工程改造,，通過一次構(gòu)建產(chǎn)生16種突變菌株的組合,，成功將化學品乙偶姻的產(chǎn)量提高了26.3 %（圖一）。
論文對Cas9突變體SpRY的識別范圍進行了系統(tǒng)掃描,，發(fā)現(xiàn)不同物種中SpRY的PAM位點具有不同的偏好性,。通過建立無偏差的PAM位點識別評估系統(tǒng)，確定了枯草芽胞桿菌中SpRY最偏好的位點為NGG,、NGA,、NAT和NAC，最不偏好的位點為NCC,、NCT,、NTC和NTA。利用枯草芽胞桿菌中SpRY的PAM識別特異性信息,，我們可以在基因組編輯過程中挑選出高活性的PAM位點,，同時避免使用效率低下的位點（圖二）。
PAM-less堿基編輯器可以實現(xiàn)對任意氨基酸的突變,，能夠?qū)蚪M98.8%的基因提前引入終止密碼子,，且超過50%的基因均可找到10個以上的編輯位點,。考慮到SpRY介導的堿基編輯器提供了大量可編輯的位點,，在全基因組水平預(yù)測和選擇高效編輯位點將是一項耗時的工作,。為此，我們開發(fā)了一個在線網(wǎng)站（https://bitguolab-bsbe-main-wphd8g.streamlit.app/）,，用于快速檢索和生成SpRY介導的堿基編輯器靶向序列,，該網(wǎng)站將大幅推動基因失活操作中的gRNA高通量設(shè)計（圖三）。
此項工作結(jié)合了郭淑元教授在芽胞桿菌中的研究基礎(chǔ)和霍毅欣教授團隊在基因編輯技術(shù)方面的長期積累,。近兩年,，雙方已經(jīng)合作發(fā)表了一系列高水平論文，包括枯草芽胞桿菌密碼子拓展底盤的建立（ ACS Synthetic Biology , 2023, 12(2):583-595）,、枯草芽胞桿菌長片段敲除系統(tǒng)的建立及基因組敲除庫的構(gòu)建（ International Journal of Molecular Sciences , 2022, 23(9):48-53）,，以及堿基編輯領(lǐng)域研究進展的綜述（ Biology , 2022, 11, 571）、食品添加劑香蘭素的生物合成策略綜述 （ Microbial Cell Factories , 2023, In revision）,。
該項工作得到了國家重點研發(fā)計劃、國家自然科學基金以及北京市自然科學基金的支持,。
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