北理工課題組在一種中性單分子載體遞送磷/膦酸鹽藥的研究中取得新進展
發(fā)布日期：2025-05-26 供稿：化學(xué)與化工學(xué)院 攝影：化學(xué)與化工學(xué)院
編輯：田柳 審核：王振華 閱讀次數(shù)：
近日，北京理工大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院吳彪教授、唐娟特別研究員和趙偉特別研究員在國際知名化學(xué)期刊《Angewandte Chemie International Edition》上發(fā)表題目為“A Neutral Single-Molecule Carrier for Delivery of Phosphonate Drugs”的研究論文。該論文的第一作者為北京理工大學(xué)博士研究生聶清玲。此項研究得到了國家自然科學(xué)基金，北京市自然科學(xué)基金和北京理工大學(xué)青年教師學(xué)術(shù)啟動計劃等項目的資助及北京理工大學(xué)分析測試中心的支持。
磷/膦酸基團是抗病毒、抗腫瘤及抗骨質(zhì)疏松藥物的關(guān)鍵活性基團，然而其高親水性和多重負(fù)電荷特性嚴(yán)重阻礙該類藥物的跨膜轉(zhuǎn)運，導(dǎo)致生物利用度低（例如，臨床使用的雙膦酸鹽的生物利用度僅為1%）。為提高磷/膦酸鹽藥物（PDs）療效并減少其副作用，現(xiàn)有策略包括：（1）小分子酯化修飾，以增強親脂性，但需要對藥物分子逐一進行修飾；（2）納米顆粒載體，雖具廣泛的藥物適應(yīng)性，卻存在載藥量批次間差異大的問題而導(dǎo)致臨床應(yīng)用受限制。針對上述科學(xué)問題，亟待開發(fā)可通過明確結(jié)構(gòu)實現(xiàn)明確的藥物負(fù)載且具有廣譜藥物適應(yīng)性的載體。單分子載體憑借分子級精準(zhǔn)封裝能力成為新興解決方案。然而，具有水合能高、幾何形狀復(fù)雜的磷/膦酸藥物與載體間有效結(jié)合是極具挑戰(zhàn)性的。目前的研究僅有兩例陽離子型環(huán)糊精衍生物作為分子載體通過靜電作用結(jié)合三磷酸鹽實現(xiàn)細(xì)胞水平的遞送（ Sci. Rep. 2017, 7, 8353.； Angew. Chem. Int. Ed. 2018, 57, 9891-9895.）。
團隊前期開發(fā)的三足六脲配體（ Chem. Sci . 2019, 10, 2483-2488; Chem. Commun . 2023, 59, 12923-12926.; Angew. Chem. Int. Ed . 2024, 63, e202403314.）通過12個預(yù)組織氫鍵結(jié)合磷酸鹽物種，其常數(shù)（ K a）高達(dá) 106 M?1。為了通過“籠效應(yīng)”進一步提高結(jié)合親和力，本研究設(shè)計了一種由兩個六脲單元通過剛性苯基連接的中性籠狀結(jié)構(gòu)（cage 1）。該載體通過預(yù)組織的多重氫鍵與多種PDs（包括單磷酸鹽、雙膦酸鹽及三磷酸鹽）形成強效結(jié)合，并利用動態(tài)氫鍵特性實現(xiàn)水性環(huán)境中的可控釋放（圖1A）。晶體結(jié)構(gòu)與功能驗證表明，cage 1可自適應(yīng)調(diào)整腔體構(gòu)象以適配不同尺寸藥物分子，進一步通過大胞飲內(nèi)吞途徑將藥物高效遞送至溶酶體，為克服傳統(tǒng)遞送難題提供了創(chuàng)新思路。
圖1 cage1跨膜轉(zhuǎn)運磷/膦酸鹽藥物示意圖
以硫酸根離子為模板，三足三脲前體與1,4-亞苯基二異氰酸酯通過一鍋法反應(yīng)合成十二脲分子籠（cage 1）。單晶分析表明，cage 1與不同PDs以1:2結(jié)合（圖1B），每個陰離子通過多重氫鍵穩(wěn)定結(jié)合于六脲單元內(nèi)。籠狀結(jié)構(gòu)的軸向高度及中間苯環(huán)形成的空腔可動態(tài)調(diào)整以適配不同尺寸陰離子。核磁共振（NMR）滴定分析顯示（圖2A），連續(xù)滴定PDs導(dǎo)致cage 1的NH質(zhì)子產(chǎn)生顯著低場位移，伴隨復(fù)合物特征峰的出現(xiàn)，證明PDs與cage 1在NMR時間尺度下存在慢交換熱力學(xué)結(jié)合機制。溶劑極性效應(yīng)實驗證實，水含量的梯度增加（從0.5%增加至20%（H2O/DMSO- d 6））顯著削弱配合物主客體間的氫鍵相互作用（圖2B），導(dǎo)致cage 1與PDs的結(jié)合常數(shù)呈現(xiàn)數(shù)量級遞減：從106 M?1降至104 M?1。由此推演，純水溶液中cage 1與PDs的結(jié)合常數(shù)將顯著降低（<<10<>4 M?1），再次驗證cage 1在水環(huán)境中能夠高效釋放PDs。等溫滴定量熱法（ITC）測得的復(fù)合物1?PD的結(jié)合常數(shù) K a1為106~ 107 M?1（圖2C），與磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白（ K a = 106 M?1）相當(dāng)，且不同PD底物間的結(jié)合常數(shù)差異極小，同樣表明cage 1具有自適應(yīng)陰離子結(jié)合特性。
圖2 cage1與PD的結(jié)合
為評估cage 1對PDs的遞送效果，本研究首先測試了cage 1對多種腫瘤細(xì)胞（如HeLa、HepG2、MDA-MB-231、PC-3和 4T1）的細(xì)胞毒性，即使在100 μM條件下，細(xì)胞存活率仍顯著高于安全閾值，凸顯其優(yōu)異的生物相容性。本研究首先采用熒光標(biāo)記的單磷酸鹽、雙膦酸鹽（BPs）及三磷酸鹽作為模型藥物，通過共聚焦顯微鏡直觀展示了復(fù)合物的胞內(nèi)積累效果。結(jié)果顯示，cage 1?PDs復(fù)合物處理的細(xì)胞其熒光強度較游離藥物組顯著增強了33~45倍（圖3A, 3B），文獻中帶正電荷的環(huán)糊精遞送的PD在MCF7細(xì)胞中的熒光強度只提高了5倍。抗腫瘤細(xì)胞增殖實驗進一步證明，相比起游離的雙膦酸鹽，cage 1遞送的雙膦酸鹽對腫瘤細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的增殖抑制效率提升2-4倍（圖3C, 3D），且該效果在多種細(xì)胞系中均保持一致（圖3E）。相較于與原藥酯化（提高1.3倍）或非靶向單功能雙膦酸鹽納米載體（效果忽略不計），cage 1展現(xiàn)更優(yōu)越的遞送效率。cage 1通過精準(zhǔn)PD藥物負(fù)載與可控釋放，為改善磷/膦酸鹽類藥物的臨床療效提供了可靠依據(jù)。
圖3. cage1在活細(xì)胞中遞PDs的實驗
本研究進一步探究了蛋白對cage 1遞送PD的作用。首先，共聚焦成像（CLSM）分析顯示，復(fù)合物的細(xì)胞攝取高度依賴血清蛋白（圖4A, 4B）：在含胎牛血清（FBS）或BSA的培養(yǎng)基中，胞內(nèi)熒光強度顯著提升，而無蛋白條件下PDs的內(nèi)化效率顯著降低，表明蛋白冠通過疏水屏蔽作用維持PDs與cage 1的結(jié)合穩(wěn)定性。動態(tài)光散射（DLS）研究表明，cage 1?PD復(fù)合物在含血清環(huán)境中形成~200 nm納米聚集體（適配大胞飲途徑）；而無血清條件下因缺乏蛋白冠保護導(dǎo)致聚集體尺寸增至~4.2 μm。熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）分析進一步證實cage 1可介導(dǎo)血清白蛋白（BSA）與PDs形成穩(wěn)定三元復(fù)合物，而游離PDs無此結(jié)合特性。最后，本研究深入探究了配合物的細(xì)胞內(nèi)化機制。通過配合物內(nèi)吞抑制實驗結(jié)合透射電鏡（TEM）（圖4C）觀察到的特征性細(xì)胞膜內(nèi)陷及直徑>500 nm的囊泡結(jié)構(gòu)，確認(rèn)大胞飲作用為其主要攝取途徑。PDs與溶酶體共定位實驗進一步揭示配合物經(jīng)大胞飲內(nèi)吞后靶向溶酶體/內(nèi)體區(qū)室（圖4D），PDs的釋放過程與蛋白質(zhì)冠解離及溶酶體酸化微環(huán)境存在協(xié)同作用（圖4E）。體內(nèi)分布實驗證實cage 1?PD配合物通過增強滲透與滯留（EPR）效應(yīng)實現(xiàn)腫瘤組織特異性積累，其腫瘤區(qū)域熒光強度較游離藥物提升（圖4F）。這種具有腫瘤選擇性的遞送方式可實現(xiàn)磷/膦酸鹽類治療藥物（包括核苷酸類似物和寡聚核酸藥物）的精確靶向，從而有效抑制腫瘤和進行聯(lián)合治療，推動精準(zhǔn)腫瘤學(xué)的前沿發(fā)展。
圖4 探索細(xì)胞攝取PD復(fù)合物的途徑
綜上所述，我們開發(fā)了一種中性陰離子受體（cage 1）作為單分子載體，基于陰離子配位策略成功解決了PDs的遞送難題。cage 1與PD的結(jié)合親和力達(dá)106~107 M?1，與天然磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白相當(dāng)。cage 1遞送的PDs通過大胞飲內(nèi)吞途徑進入細(xì)胞，并將藥物輸送到溶酶體，使細(xì)胞內(nèi)的藥物富集量增加33-45倍，并使PDs對腫瘤細(xì)胞的增殖抑制效果提高2-4倍。體內(nèi)實驗證實其可通過增強滲透與滯留（Enhanced Permeability and Retention effect，EPR）效應(yīng)實現(xiàn)配合物在腫瘤部位選擇性富集。該遞送策略具有以下主要優(yōu)勢：（a）分子級封裝，可精確裝載藥物；（b）cage 1使PDs親水性和負(fù)電荷密度降低，易于穿透細(xì)胞；以及（c）主客體通過動態(tài)氫鍵結(jié)合，藥物釋放可控。該研究為設(shè)計電中性的單分子載體遞送磷酸鹽藥物提供了新的思考方向。
原文鏈接： https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/anie.202509002
附通訊作者簡介：
吳彪，北京理工大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院教授，博導(dǎo)，國家級領(lǐng)軍人才。現(xiàn)任醫(yī)藥分子科學(xué)與制劑工程工信部重點實驗室主任。原創(chuàng)性地發(fā)展了“陰離子配位超分子組裝化學(xué)”研究方向，在JACS，ACIE等國際知名高水平期刊發(fā)表學(xué)術(shù)論文200余篇，科研成果獲省部級科學(xué)技術(shù)一等獎。研究方向為通過設(shè)計和合成陰離子配體、研究其配位性質(zhì)，發(fā)展和完善陰離子配位化學(xué)理論，指導(dǎo)高級有序組裝結(jié)構(gòu)的精準(zhǔn)構(gòu)筑和功能控制。
唐娟，特別研究員，博導(dǎo)。2020年12月加入北京理工大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，研究方向主要集中在化學(xué)與生命科學(xué)的交叉領(lǐng)域，旨在通過發(fā)展化學(xué)工具探測和調(diào)節(jié)生命過程，揭示生物事件的發(fā)生發(fā)展規(guī)律，為疾病的治療提供新思路。包括：1）發(fā)展低能量光可活化熒光探針監(jiān)測細(xì)胞通訊動力學(xué)；2）發(fā)展陰離子配體靶向性治療癌癥；3）發(fā)展不含重金屬的光敏劑用于癌癥的光動力治療。主持國家自然科學(xué)基金青年項目，北理工青年教師學(xué)術(shù)啟動計劃和北京理工大學(xué)科技創(chuàng)新計劃科研基地科技支撐專項計劃。在國內(nèi)外學(xué)術(shù)刊物上發(fā)表學(xué)術(shù)論文30余篇，包括 J. Am. Chem. Soc., Angew. Chem. Int. Ed., Chem. Sci. 等。
趙偉，特別研究員，博導(dǎo)。2020年7月加入北京理工大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，從事陰離子配位作用相關(guān)的超分子化學(xué)研究，包括配體分子的理性設(shè)計、結(jié)構(gòu)調(diào)控及其在離子分離純化等領(lǐng)域的應(yīng)用。主持國家自然科學(xué)基金、北京市自然科學(xué)基金和北理工青年教師學(xué)術(shù)啟動計劃。近年來，授權(quán)國家發(fā)明專利2項，在國內(nèi)外學(xué)術(shù)刊物上發(fā)表學(xué)術(shù)論文40余篇，包括 Science, Chem, J. Am. Chem. Soc., Angew. Chem. Int. Ed., CCS Chemistry 等。
分享到：