北理工團(tuán)隊(duì)在生物法合成天然產(chǎn)物糖苷類藥物領(lǐng)域取得重要進(jìn)展
發(fā)布日期：2024-08-27 供稿：化學(xué)與化工學(xué)院 攝影：化學(xué)與化工學(xué)院
編輯：田柳 審核：王振華 閱讀次數(shù)：
三萜化合物是一類重要的植物天然產(chǎn)物,，因其獨(dú)特的藥理活性而受到廣泛關(guān)注,。然而,，由于分子中的疏水碳環(huán)結(jié)構(gòu),，三萜化合物普遍存在溶解度低和生物利用度差的問題,。糖基修飾可顯著改善三萜化合物的水溶性,，因此三萜化合物多以糖苷的形式存在,。其中,，直鏈三糖基修飾是一種重要的糖基修飾類型，對發(fā)揮三萜化合物獨(dú)特的藥理活性具有重要意義,。相較于化學(xué)合成法,，利用酶法合成三萜糖苷化合物具有反應(yīng)條件溫和、定向催化和環(huán)境友好等優(yōu)勢,，特別是在合成具有復(fù)雜多糖基修飾的三萜糖苷化合物時(shí),，酶法可避免化學(xué)合成法中繁雜的基團(tuán)保護(hù)與去保護(hù)過程。尿苷二磷酸-糖基轉(zhuǎn)移酶（uridine diphosphate glycosyltransferases,，UGTs）是催化天然產(chǎn)物糖基修飾的主要生物催化劑,，在目前已報(bào)道的UGTs中，大多僅催化三萜單糖苷和二糖苷的合成,，具有直鏈三糖基修飾催化活性的UGTs數(shù)量極少,，限制了三萜直鏈三糖苷的酶法合成。此外,，該類型UGTs的催化功能特點(diǎn)和底物特異性的分子機(jī)制也不清晰,。針對以上問題，本研究通過生物信息學(xué)分析,、結(jié)合體外酶學(xué)性質(zhì)表征系統(tǒng)發(fā)掘可催化合成三萜直鏈三糖苷的UGTs,，并揭示該類型UGTs催化底物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，通過祖先酶序列重構(gòu),、氨基酸突變和計(jì)算機(jī)模擬等手段闡明其底物特異性的分子機(jī)制,。相關(guān)研究成果以“Engineering the Substrate Specificity of UDP-Glycosyltransferases for Synthesizing Triterpenoid Glycosides with a Linear Trisaccharide as Aided by Ancestral Sequence Reconstruction”為題目在國際知名期刊Angewante Chemie International Edition上發(fā)表（DOI: /10.1002/anie.202409867）。北京理工大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院博士研究生簡行為該論文的第一作者,，清華大學(xué)李春教授與北京理工大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院長聘副教授馮旭東為該論文的共同通訊作者,。
本研究首先對7個(gè)UGT91H亞家族酶進(jìn)行系統(tǒng)性表征，結(jié)果表明7個(gè)UGTs對14個(gè)三萜化合物有催化活性,，特異性的在其C2 '' -OH修飾一分子糖基,，成功合成26個(gè)三萜直鏈三糖苷。揭示了7個(gè)UGT91H亞家族酶催化糖基受體底物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：僅可催化在C3-OH修飾二糖基且第一個(gè)糖基為葡萄糖醛酸基或葡萄糖基的三萜化合物，而對三萜苷元或三萜單糖苷則沒有催化活性,。另外,，7個(gè)UGTs對UDP-糖基供體具有較為嚴(yán)格的特異性，對UDP-鼠李糖（UDP-Rha）具有最高的偏好性,，對UDP-木糖（UDP-Xyl）次之,，而對其他UDP-糖供體則沒有催化活性。
利用祖先酶序列重構(gòu)技術(shù)獲得UGT91H亞家族的祖先酶UGT91H_A1,， 其在保留UGT91H亞家族現(xiàn)代酶直鏈三糖基修飾功能外,，表現(xiàn)出了更廣的底物譜和更高的活性。在糖基受體方面,，UGT91H_A1可催化17個(gè)三萜化合物修飾一分子糖基,。在糖基供體方面，除UDP-Rha和 UDP-Xyl之外,，UGT91H_A1還具有高效利用UDP-葡萄糖（UDP-Glc）的活性,。最后利用UGT91H_A1成功合成了 33個(gè)三萜直鏈三糖苷。
進(jìn)一步闡明了UGT91H_A1中非保守的RTAS Loop對UGT91H亞家族酶的底物特異性具有重要影響,。將RTAS Loop替換至UGT91H8 和UGT91H7對應(yīng)區(qū)域,，分別獲得突變體UGT91H_6mu和UGT91H7M，均具有催化新底物α-常春藤苷（17）糖基修飾的活性,。分子動(dòng)力學(xué)模擬和量子力學(xué)計(jì)算表明,，RTAS Loop通過影響酶和底物的相互作用和結(jié)合能來調(diào)控酶的底物特異性。
針對糖基供體UDP-Rha成本高的問題,，構(gòu)建了包括蔗糖合酶 Gu SUS1-Δ9,、UDP-Rha 合酶 At RHM2和雙功能鼠李糖合酶 At NRS/ER的三酶級聯(lián)體系，實(shí)現(xiàn)了以廉價(jià)的蔗糖為原料合成UDP-Rha,。將該體系與UGT91H_A1偶聯(lián)的四酶體系（分步法）降低了甘草次酸 3- O -GlcA-Gal-Rha（2a）和常春藤皂苷元 3- O -Ara-Rha-Rha（17a）的合成成本,，底物轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到80.1 ± 0.3%和61.3 ± 4.1%。
以上述表征的UGT91H亞家族酶的序列為探針,，建立了基于進(jìn)化分析的快速酶挖掘方法,，對NCBI數(shù)據(jù)庫中8種豆科植物基因組進(jìn)行系統(tǒng)分析和挖掘，共獲得23個(gè)候選酶,，最終證實(shí)19個(gè)為UGT91H亞家族酶,，大大提高了酶挖掘的效率和準(zhǔn)確性。從中挑選了PNY09112.1,、GAU40116.1和PNX78912.1進(jìn)行功能表征,，均表現(xiàn)出對三萜化合物C2 '' -OH特異性修飾一分子鼠李糖基或木糖基的活性。此外,，GAU40116.1和PNY09112.1還對UDP-Gal具有微弱的新活性,。
本研究系統(tǒng)探索了UGT91H亞家族酶的催化功能特點(diǎn),，并利用祖先酶重構(gòu)技術(shù)拓展了該亞家族酶的底物譜，實(shí)現(xiàn)23個(gè)新型三萜直鏈三糖苷的酶法合成,。鑒定了影響UGT91H_A1底物特異性的關(guān)鍵區(qū)域RTAS Loop,，并通過對UGT91H亞家族酶中RTAS Loop相應(yīng)區(qū)域的突變，實(shí)現(xiàn)了該亞家族酶底物特異性的調(diào)控,。還開發(fā)了基于進(jìn)化分析的UGT91H亞家族酶的快速挖掘方法,。本研究為進(jìn)一步拓展三萜化合物更多酶法糖基化修飾類型提供了新思路和新方法。
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