北理工在原核生物基因組編輯技術(shù)的優(yōu)化及應(yīng)用方面取得重要研究成果
發(fā)布日期：2019-09-12 供稿：生命學(xué)院 攝影：生命學(xué)院
編輯：秦奎偉 審核：徐偉 閱讀次數(shù)：近日,，北京理工大學(xué)生命學(xué)院霍毅欣課題組在原核生物CRISPR基因組編輯技術(shù)的優(yōu)化及應(yīng)用方面再次取得重要研究成果,，并發(fā)表于TOP（頂級(jí)）期刊《Applied Microbiology and Biotechnology》,。論文的第一作者為2019級(jí)博士生黃潮勇,，通訊作者為霍毅欣教授,，天工所張學(xué)禮和畢昌浩研究員,、北理工馬曉焉特別副研究員參與了這項(xiàng)研究,。該研究的部分工作在北理工—洛加大蘇州研究院聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室完成,，項(xiàng)目獲得國(guó)家自然基金委面上項(xiàng)目、科技部重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目,、北京理工大學(xué)科技創(chuàng)新項(xiàng)目,、以及蘇州工業(yè)園區(qū)的資助。該課題組不久前剛在Q1期刊《Microbial Cell Factories》上發(fā)表相關(guān)領(lǐng)域研究成果,，論文的第一作者為2019屆碩士畢業(yè)生張姣,，通訊作者為霍毅欣教授；植生所蔣宇研究員參與了這項(xiàng)研究,。
CRISPR/Cas9作為新一代基因組編輯技術(shù),，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物,、植物以及微生物的基因組編輯。該技術(shù)利用化膿性鏈球菌來(lái)源的Cas9蛋白（SpCas9）產(chǎn)生位點(diǎn)特異性DNA雙鏈斷裂,，再通過細(xì)胞的同源重組（HR）或非同源末端連接（NHEJ）機(jī)制修復(fù)雙鏈斷裂,，同時(shí)在基因組上引入所需要的突變。與真核生物不同,，原核生物普遍難以修復(fù)DNA雙鏈斷裂,，絕大多數(shù)細(xì)菌缺乏NHEJ系統(tǒng)，而只具有效率很低的HR系統(tǒng),。因此,，大多數(shù)研究者選擇將CRISPR/Cas9與重組工程相結(jié)合，通過過表達(dá)噬菌體來(lái)源的λ-Red系統(tǒng)（一種效率很高的HR系統(tǒng)）幫助原核生物修復(fù)DNA雙鏈斷裂,，從而提高編輯效率,。與NHEJ介導(dǎo)的基因組編輯相比，HR介導(dǎo)的基因組編輯需要一個(gè)供體DNA作為編輯模板,，這使基因組編輯操作變得復(fù)雜,。研究表明，某些原核生物具有類似真核生物的簡(jiǎn)化版NHEJ系統(tǒng),，這些NHEJ系統(tǒng)只需要兩個(gè)功能蛋白Ku和LigD,。大腸桿菌一直以來(lái)被認(rèn)為缺乏NHEJ系統(tǒng)，近年來(lái),，國(guó)內(nèi)有研究者將結(jié)核分枝桿菌和恥垢分枝桿菌來(lái)源的NHEJ系統(tǒng)導(dǎo)入大腸桿菌,，成功地開發(fā)出了一種不依賴HR的基因組編輯方法用于快速刪除大腸桿菌基因組序列，大大加速了大腸桿菌遺傳改造的進(jìn)程,。事實(shí)上,，國(guó)外有研究者證明大腸桿菌具有一個(gè)類似于NHEJ的末端連接系統(tǒng)（研究者將其命名為A-EJ），該系統(tǒng)的功能蛋白不是Ku和LigD,，而是RecBCD和LigA,。由于A-EJ修復(fù)DNA雙鏈斷裂的效率遠(yuǎn)低于NHEJ，目前還沒有利用A-EJ進(jìn)行基因組編輯的報(bào)道,。是否有可能用A-EJ代替NHEJ進(jìn)行基因組編輯呢,？答案是肯定的。
圖1 基于CNEE的基因組編輯流程
北京理工大學(xué)生命學(xué)院的霍毅欣教授課題組利用David Liu課題組開發(fā)的 xCas9-3.7（SpCas9的進(jìn)化版突變體）和Jennifer Doudna課題組改造的sgRNA（tracrRNA : crRNA的強(qiáng)化版融合體）構(gòu)建了一個(gè)雙質(zhì)粒嚴(yán)謹(jǐn)誘導(dǎo)型的基因組編輯系統(tǒng),，并將其命名為CNEE,。該系統(tǒng)極為簡(jiǎn)單，其功能組件只有Cas9和sgRNA,，沒有任何外源的DNA修復(fù)蛋白,，利用該系統(tǒng)，即使宿主的DNA修復(fù)系統(tǒng)效率極低,，也能高效率地進(jìn)行基因組編輯,。該課題組將CNEE系統(tǒng)導(dǎo)入大腸桿菌,，在宿主A-EJ系統(tǒng)的協(xié)助下，實(shí)現(xiàn)了高效的基因敲除和長(zhǎng)達(dá)83 kb的大片段刪除（圖1）,。這種方法不需要編輯模板,，可以實(shí)現(xiàn)快速迭代的大腸桿菌遺傳改造，并且編輯效率不依賴于高轉(zhuǎn)化活性的宿主細(xì)胞,。由于RecBCD和LigA（或它們的同源基因）在所有的原核生物中都存在,，因此理論上CNEE系統(tǒng)適用于任何原核生物的基因組編輯。隨后,，該課題組在CNEE的基礎(chǔ)上構(gòu)建了一個(gè)變異系統(tǒng),，為了方便描述，暫且把該系統(tǒng)稱為CNEE-V1,。將CNEE-V1導(dǎo)入大腸桿菌,，可以在宿主RecA同源重組系統(tǒng)的協(xié)助下實(shí)現(xiàn)高效精確的基因組編輯,，包括序列的刪除,、插入和替換。CNEE-V1是對(duì)CNEE的有效補(bǔ)充,；由于RecA（或它的同源基因）在所有的原核生物中都存在,，因此理論上CNEE-V1也適用于任何原核生物的基因組編輯。此外,，該課題組還證明,，將分枝桿菌來(lái)源的NHEJ系統(tǒng)引入CNEE可以進(jìn)一步增強(qiáng)CNEE的性能；同樣,，將噬菌體來(lái)源的λ-Red系統(tǒng)可以進(jìn)一步增強(qiáng)CNEE-V1的性能,。相關(guān)成果發(fā)表于TOP（頂級(jí)）期刊《Applied Microbiology and Biotechnology》，原文鏈接：https://doi.org/10.1007/s00253-019-10104-w
圖2 谷氨酸棒桿菌遺傳改造提高異丁酸產(chǎn)量
CRISPR/Cpf1是繼CRISPR/Cas9之后被開發(fā)出來(lái)的基因組編輯系統(tǒng),。與CRISPR/Cas9相比,，CRISPR/Cpf1脫靶率更低且所需的核酸酶和RNA分子更小，因此在基因組編輯領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力,。然而,，編輯效率相對(duì)較低限制了CRISPR/Cpf1基因編輯系統(tǒng)的應(yīng)用。谷氨酸棒桿菌是一種重要的工業(yè)生產(chǎn)菌株,，此前,，研究者利用CRISPR/Cpf1在谷氨酸棒桿菌中進(jìn)行基因組編輯的效率低于15%，且無(wú)法利用線性DNA作為修復(fù)模板,。因此,，該課題組針對(duì)谷氨酸棒桿菌的基因組編輯對(duì)CRISPR/Cpf1系統(tǒng)進(jìn)行了系統(tǒng)的優(yōu)化，優(yōu)化參數(shù)包括PAM序列,、間隔序列的長(zhǎng)度,、修復(fù)模板的類型,。利用優(yōu)化后的CRISPR/Cpf1系統(tǒng)在谷氨酸棒桿菌中進(jìn)行基因組編輯的效率顯著提高，且可以利用線性DNA作為修復(fù)模板,。隨后,，該課題組利用優(yōu)化后的CRISPR/Cpf1系統(tǒng)對(duì)野生型谷氨酸棒桿菌進(jìn)行遺傳改造，通過敲除基因 pyc ,、 ldh 和 adhA 成功地提高了異丁酸的產(chǎn)量（圖2）,。相關(guān)成果發(fā)表于《Microbial Cell Factories》，原文鏈接：https://doi.org/10.1186/s12934-019-1109-x
附霍毅欣簡(jiǎn)介：
霍毅欣教授本科畢業(yè)于南開大學(xué),，獲北京大學(xué)和巴黎七大雙博士學(xué)位,，曾經(jīng)在法國(guó)巴斯德研究所、美國(guó)加州大學(xué)洛杉磯分校等歐美科研院校和生物公司學(xué)習(xí)和工作十三年,，兼有在學(xué)術(shù)界從事基礎(chǔ)研究和工業(yè)界開展應(yīng)用轉(zhuǎn)化研究的經(jīng)歷,。2016年起在北京理工大學(xué)組建代謝工程課題組，圍繞著“天然資源的微生物精煉與制造”,，以“人工細(xì)胞工廠的設(shè)計(jì)-構(gòu)建-篩選-放大”為主線,，以多種模式生物為研究對(duì)象，開展了一系列研究,，取得了多項(xiàng)研究成果,。自2018年以來(lái)以通訊作者或第一作者身份在頂級(jí)期刊Nature Communications（1篇）、Metabolic Engineering（1篇）,、Applied Microbiology and Biotechnology（4篇）,、Current Opinion in Biotechnology（1篇）及重要期刊ACS Synthetic Biology（1篇）、Microbial Cell Factories（2篇）,、Engineering（1篇）,、Journal of Biotechnology （1篇）、JoVE（1篇）上發(fā)表論文,，申請(qǐng)多項(xiàng)發(fā)明專利,。
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